Isolering av mRNA fra totalt RNA
1.
TRIzol homogenisering: Total RNA inkluderer all mRNA, overførings RNA, ribosomal RNA og andre ikke-kodende RNAer. For å skille disse fra andre cellekomponenter, blir cellen først åpnet for å frigjøre innholdet. Dette gjøres ved resuspensjon av celler som pelleteres ved sentrifugering (spinning ved høye hastigheter) i TRIzol Reagent (Life Technologies). Andre versjoner av TRIzol (som Ambion's TRI Reagent) fungerer på samme måte.
2.
Total RNA-isolasjon: En serie sentrifugeringer brukes til å skille de forskjellige komponentene DNA, RNA) av cellen i lag eller faser, inne i suspensjonen. Den øverste, gulfargede fasen er sammensatt av fett og kan kasseres. Den ønskede fasen er tonet rød, inneholder total RNA og beholdes. en fenol-kloroform-ekstraksjon og en serie med alkohol vasker med isopropanol og etanol, kan RNA pelleteres for mRNA-isolasjon. Legg til RNase-hemmere for å forhindre at dette enzymet nedbryter total RNA.
>
mRNA-ekstraksjon: Det er vanlig å bruke et kit for å isolere mRNA, da hjemmelagde laboratorieprotokoller ikke genererer store mengder høyrensede mRNA. Kommersielle sett inkluderer Invitrogen s FastTrack 2.0 eller Ambion's Poly (A) Ren mRNA Isolasjonssett. Disse grunnleggende trinnene er vanlige for slike kits:
a) Bland den RNase-hemmede lysisbufferen som er gitt i settet med opptil 300 mikroliter av totalt RNA.
b) Varm i 5 minutter ved 65 grader Celsius og køl deretter prøven på is i ett minutt.
c) Bland Dette med 0,5M natriumklorid og deretter oppløs Oligo dT (oligodeoxythymidylsyre) i denne prøven.
d) Sentrifuger denne prøven og gjenvinn supernatanten, som vaskes flere ganger i en serie av bindende og lav saltbuffere som er gitt i kittene.
e) Eliminer mRNA flere ganger til et kit-spesifisert volum (f.eks. 500 mikroliter) oppnås.
f) Precipitere eluatet med natriumacetat og etanolutfelling. Resuspender i opptil 20 mikroliter av dietylpyrokarbonat (DEPC) -behandlet vann.
g) Oppbevar ved -80 grader Celsius og kontroller for kvalitet og kvantitet ved spektrofotometri.
< h4> Tips og advarsler