Slik isolerer du MRNA fra en celle

 

Isolering av mRNA fra totalt RNA

1.

TRIzol homogenisering: Total RNA inkluderer all mRNA, overførings RNA, ribosomal RNA og andre ikke-kodende RNAer. For å skille disse fra andre cellekomponenter, blir cellen først åpnet for å frigjøre innholdet. Dette gjøres ved resuspensjon av celler som pelleteres ved sentrifugering (spinning ved høye hastigheter) i TRIzol Reagent (Life Technologies). Andre versjoner av TRIzol (som Ambion's TRI Reagent) fungerer på samme måte.

2.

Total RNA-isolasjon: En serie sentrifugeringer brukes til å skille de forskjellige komponentene DNA, RNA) av cellen i lag eller faser, inne i suspensjonen. Den øverste, gulfargede fasen er sammensatt av fett og kan kasseres. Den ønskede fasen er tonet rød, inneholder total RNA og beholdes. en fenol-kloroform-ekstraksjon og en serie med alkohol vasker med isopropanol og etanol, kan RNA pelleteres for mRNA-isolasjon. Legg til RNase-hemmere for å forhindre at dette enzymet nedbryter total RNA.

>

mRNA-ekstraksjon: Det er vanlig å bruke et kit for å isolere mRNA, da hjemmelagde laboratorieprotokoller ikke genererer store mengder høyrensede mRNA. Kommersielle sett inkluderer Invitrogen s FastTrack 2.0 eller Ambion's Poly (A) Ren mRNA Isolasjonssett. Disse grunnleggende trinnene er vanlige for slike kits:

a) Bland den RNase-hemmede lysisbufferen som er gitt i settet med opptil 300 mikroliter av totalt RNA.

b) Varm i 5 minutter ved 65 grader Celsius og køl deretter prøven på is i ett minutt.

c) Bland Dette med 0,5M natriumklorid og deretter oppløs Oligo dT (oligodeoxythymidylsyre) i denne prøven.

d) Sentrifuger denne prøven og gjenvinn supernatanten, som vaskes flere ganger i en serie av bindende og lav saltbuffere som er gitt i kittene.

e) Eliminer mRNA flere ganger til et kit-spesifisert volum (f.eks. 500 mikroliter) oppnås.

f) Precipitere eluatet med natriumacetat og etanolutfelling. Resuspender i opptil 20 mikroliter av dietylpyrokarbonat (DEPC) -behandlet vann.

g) Oppbevar ved -80 grader Celsius og kontroller for kvalitet og kvantitet ved spektrofotometri.

< h4> Tips og advarsler

  • Hold alle reagenser, celler og RNA kaldt ved å nedsenke i is. Dette forhindrer at RNA nedbrytes av andre enzymer som slippes ut under homogeniseringsprosessen.
  • Reagenser som TRIzol er giftige og må ikke komme i kontakt med hud eller slimhinner. Følg alltid sikre laboratorieprotokoller når du håndterer dette reagenset.
  • En celles genetiske blåkopi er kodet innenfor sitt genetiske materiale eller DNA. Da DNA aldri forlater kjernen i cellen, for at denne informasjonen skal komme inn i cytoplasmaen der andre proteiner og biokjemiske komponenter er bosatt, er det nødvendig å først transkriberer DNA til messenger-RNA (mRNA eller poly (A) RNA). Dette mRNA blir da oversatt til proteiner som utfører mange funksjoner i cellen. For å oppdage eller kvantifisere svært sjeldne mRNAer, lage prober for mikroarrays eller konstruere biblioteker av komplementært DNA molekyler, mRNA må isoleres. Imidlertid er total RNA (dvs. all RNA i en celle) ekstraksjon og påfølgende mRNA-isolasjon ikke hverandre eksklusive prosesser, den tidligere må utføres for at mRNA skal ekstraheres.